Microsporogénesis y ultraestructura de los granos de polen en la planta del cacao, Theobroma cacao (Malvaceae)

Introducción: No conocemos estudios sobre la microsporogénesis de la planta de cacao, y poco se sabe sobre la ultraestructura de sus granos de polen. Objetivo: Describir la microsporogénesis y ultraestructura de los granos de polen en T. cacao. Métodos: Procesamos más de 30 flores para cada etapa floral, teñidas con Safranina-Azul Alcian, PAS-Amidoblack y Lacmoid. Para la microscopía de transmisión procesamos las muestras en resina y las teñimos con azul de toluidina. Para microscopía electrónica de barrido, fijamos y deshidratamos en 2.2-dimetoxipropano, secamos hasta un punto crítico y recubrimos con oro. Resultados: Anteras diferenciadas por una masa celular en los extremos distales a los filamentos estaminales. Durante el desarrollo la pared de las anteras presenta varios estratos celulares y al madurar se reducen a la epidermis y al endotecio. Las células madre de microsporas se dividen por meiosis para formar tétradas. El tapete es secretor e intacto hasta que se liberan los granos, para luego degenerar. Los granos de polen son isopolares, esferoidales, pequeños, tricolpados. La ultraestructura presenta una esporodermis semitectada, con ornamentación reticulada, y un retículo heterobrochado con el muri sin ornamentación. La exina se deposita antes que la intina. Los orbículos son individuales, lisos y de tamaño variado. Hay abundante polenkit en el tectum y entre las columelas. La intina es delgada, pero se desarrolla ampliamente en las áreas del colpo, formando una intina interna compacta y una intina externa inusual con una apariencia columelada. Conclusión: La estructura y el desarrollo de las anteras siguen el patrón de las angiospermas. La microsporogénesis simultánea y la deposición centrípeta de la esporodermis se conocen de Malvaceae, pero los caracteres de la intina son nuevos para la familia.

Introduction: We know of no studies on the microsporogenesis of the cocoa plant, and little is known about the ultrastructure of its pollen grains. Objective: To describe microsporogenesis and ultrastructure of pollen grains in T. cacao. Methods: We processed over 30 flowers for each floral stage and stained with Safranin-Alcian Blue, PAS-Amidoblack and Lacmoid. For transmission microscopy we processed samples on resin and stained with toluidine blue. For scanning electron microscopy, we fixed and dehydrated in 2.2-dimethoxypropane, critically dried and coated with gold. Results: Anthers differentiated by a cellular mass at the ends distal to the staminal filaments. During development, the anther wall has several cellular layers reduced, at maturity, to the epidermis and endothecium. Microspore mother cells divide by meiosis to form tetrads. The tapetum is secretory and intact until the grains are released, to later degenerate. Pollen grains are isopolar, spheroidal, small, tricolpate. Ultrastructure has a semi-tectate sporodermis, with reticulate ornamentation, and heterobrochated reticulum with the muri without ornamentation. Exine is deposited before intine. The orbicles are individual, smooth, and varied in size. There is abundant pollenkitt on the tectum and between the columellae. The intine is thin, but develops widely in the colpus areas, forming a compact internal intine and an unusual external intine with a columellated appearance. Conclusion: Anther structure and development follows the angiosperm pattern. Simultaneous microsporogenesis and centripetal deposition of the sporodermis are known from Malvaceae, but intine characters are novel for the family.

Microsporogénesis y micromorfología del polen de la planta Alcea rosea (Malvaceae) / Microsporogenesis and micromorphology of pollen grains of the plant Alcea rosea (Malvaceae)

Resumen Introducción: Los estudios sobre microsporogénesis, micromorfología y estructura de los granos de polen en Malvaceae son escasos. Objetivos: Describir el proceso de microsporogénesis y aspectos micromorfológicos de los granos de polen en A. rosea. Métodos: Se procesaron más de 30 andróforos de acuerdo con los protocolos estándar para incrustar y seccionar en parafina. Las secciones obtenidas se tiñeron con Azul de Safranina-Alcian, las anteras inmaduras y no fijadas se tiñeron con Azul de anilina. Se procesaron secciones de resina adicionales de los andróforos y se tiñeron con azul de toluidina. Se observaron secciones ultrafinas con microscopía electrónica de transmisión (MET). Para la observación con microscopía electrónica de barrido (MEB), el material se fijó y deshidrató en 2,2 dimetoxipropano, luego se secó hasta un punto crítico y se recubrieron con oro. Resultados: las anteras se diferencian de una masa celular en los extremos distales de los filamentos del estambre. La pared de la antera madura presenta una capa externa de células epidérmicas y una capa interna, el endotecio. Las células madre de microesporas se dividen por mitosis y luego experimentan meiosis para formar tétradas. El tapete es inicialmente celular y forma una sola capa de células y luego pierde integridad celular al invadir el lóculo de microsporangio, formando un periplasmodio. Durante la formación de la esporodermis, primero se deposita la exina y luego la intina. Para el momento de la liberación de los granos de polen, el tapete se ha degenerado por completo. Los granos de polen son pantoporados, apolares, con simetría radial, esferoidales, con espinas, báculas, gránulos y microgránulos. El téctum está perforado con fovéoleas dispuestas homogéneamente en toda la superficie y con polenkit. La exina es ancha (5-6 µm) y consta de una endexina gruesa de 3.5 a 4 µm y una ektexina fina (0.6-0.7 µm). La ultraestructura muestra columelas claramente definidas formando el infratéctum. Se aprecian tricomas nectaríferos unicelulares glandulares capitados (TG) cubriendo toda la superficie de los filamentos de los estambres. Conclusiones: La estructura y desarrollo de las anteras sigue los patrones conocidos de las angiospermas. La microsporogénesis simultánea y el depósito centrípeto de la esporodermis se han descrito previamente para Malvaceae.

Abstract Introduction: Studies on microsporogenesis, micromorphology and structure of pollen grains in Malvaceae are scarce. Objectives: To describe the process of microsporogenesis and micromorphological aspects of pollen grains in A. rosea. Methods: Androphores were processed according to standard protocols for sectioning in paraffin. The obtained sections were stained with Safranin-Alcian blue, Aniline blue was used for immature and unfixed anthers and for resin sections of the androphores, Toluidine blue. Ultrathin sections were observed with transmission electron microscopy. For observation with scanning electron microscopy the material was fixed and dehydrated in 2.2 dimethoxypropane, dried to a critical point and coated with gold. Results: Anthers differentiate from a cell mass at the distal ends of the stamen filaments. The wall of the mature anther presents an outer layer of epidermal cells and an inner layer, the endothecium. Microspore mother cells divide by mitosis and then undergo meiosis to form tetrads. The tapetum is initially cellular and forms a single layer of cells and then loses cellular integrity by invading the microsporangium locule, forming a periplasmodia, by the time the pollen grains are released it degenerated. During sporodermis formation, exine is first deposited and then intine. Pollen grains are pantoporate, apolar, with radial symmetry, spheroidal, with spines, bacula, granules and microgranules. Tectum is perforated with foveolae arranged homogeneously over the whole surface and pollenkit is present. Exine is broad and consists of a thick 3.5 to 4 µm endexine and a thin ektexine (0.6-0.7 µm). The ultrastructure shows columellae forming the infratectum. Capitate glandular unicellular nectariferous trichomes covers the whole surface of the stamen filaments. Conclusions: The structure and development of the anthers follows the known patterns for angiosperms. Simultaneous microsporogenesis and centripetal deposit of the sporodermis have been previously described for Malvaceae.

Micromorfología y ultraestructura de las anteras y los granos de polen en diez genotipos élite de Theobroma cacao (Malvaceae) / Micromorphology and ultrastructure of anthers and pollen grains in ten elite genotypes of Theobroma cacao (Malvaceae)

Resumen Introducción: A pesar de que T. cacao es una especie importante a nivel mundial por la producción de cacao, es poco lo que se conoce sobre la micromorfología y estructura de las anteras y los granos de polen. Objetivos: Describir y analizar la estructura y micromorfología de las anteras y los granos de polen de 10 genotipos élite de esta importante especie tropical. Métodos: Se tomaron más de 30 anteras de flores en antesis de los 10 genotipos élite de T. cacao del banco de germoplasma ex situ del Centro de Investigaciones Suiza-Agrosavia (Rionegro, Santander-Colombia). El material se procesó de acuerdo con los protocolos estándar para embeber y seccionar en parafina. Las secciones obtenidas (3 μm) se tiñeron con azul de Safranina-Alcian para discriminar estructuras con paredes primarias y secundarias y polifenoles totales. Además, se usó la técnica PAS-Amidoblack para diferenciar entre polisacáridos estructurales y de reserva, así como proteínas. Para la determinación de esporopolenina y polifenoles se usó la tinción azul de toluidina y finalmente para descripciones adicionales se aplicó la tinción azul alcián-PAS-hematoxilina. Las observaciones se realizaron mediante microscopio fotónico y microscopio de epifluorescencia. Para la observación con microscopía electrónica de barrido (MEB), las anteras con los granos de polen se fijaron y deshidrataron en 2.2 dimetoxipropano, luego se desecaron hasta un punto crítico y finalmente se recubrieron con oro. Resultados: Las anteras son bitecas y están sostenidas por un largo filamento formado por un estrato epidérmico, tejido parenquimatoso y un haz vascular. La dehiscencia ocurre longitudinalmente a través del estomio. La pared de la antera madura está formada por una capa epidérmica monoestratificada, una capa de células endoteliales con engrosamientos fibrilares lignificados y se pueden apreciar restos celulares del tapete y abundantes orbículas recubriendo la cavidad de los microesporangios. Los tejidos epidérmicos y parenquimatosos de las anteras almacenan polifenoles. Las orbículas son generalmente esféricas, psiladas y exhiben las mismas reacciones de tinción y fluorescencia que la exina de los granos de polen. Los granos de polen son mónades, isopolares, pequeños (16-19 µm) con amb circular, esferoidales, tricolpados con colpos medianos o cortos (5-10 µm) con membrana ornamentada, semitectatos, reticulados, heterobrochados, las paredes del retículo ornamentadas o no, con microgránulos de diferente tamaño o escabrados. Los análisis estadísticos mostraron que existen diferencias significativas en el tamaño de los granos de polen (P ˂ 0.05). Se observa que los granos de polen más pequeños son los del genotipo TCS 19 (16.890 µm) y se diferencian del resto de genotipos, y entre estos no se observan diferencias significativas. Solo dos genotipos (SCC 19 y SCA 6) presentaron polenkit y solo uno tiene paredes perforadas (SCA 6). Conclusiones: La estructura y micromorfología de las anteras de T. cacao son similares a las descritas para otras Malvaceae. Así mismo, los granos de polen mostraron variaciones de tamaño, ornamentación de las paredes y del lumen del retículo y presencia de polenkit. Sin embargo, no se observó relación entre las variaciones de los caracteres micromorfológicos analizados en los granos de polen y los modelos de compatibilidad polínica reportados para estos genotipos.

Abstract Introduction: Despite the fact that T. cacao is an important species worldwide for cocoa production, little is known about the micromorphology and structure of anthers and pollen grains. Objectives: To describe and analyze the structure and micromorphology of the anthers and pollen grains of 10 elite genotypes of this important tropical species. Methods: More than 30 anthers of flowers in anthesis were taken of the 10 elite genotypes of T. cacao from the ex situ germplasm bank of the Suiza-Agrosavia Research Center (Rionegro, Santander-Colombia). The anthers with the pollen grains were fixated and processed according to the standard protocols for embedding and sectioning in paraffin. Sections obtained (3 μm thick) were stained with Safranin-Alcian blue to discriminate structures with primary and secondary walls and total polyphenols. Additionally, the samples were also stained with the PAS-Amidoblack technique was used to differentiate between structural and reserve polysaccharides as well as proteins. Toluidine blue staining was used for the determination of sporopollenin and polyphenols and finally Alcian blue-PAS-Hematoxylin staining was applied for additional descriptions. Observations were made using photonic microscopy and epifluorescence microscopy. For observation with scanning electron microscopy (SEM) the anthers with the pollen grains were fixed and dehydrated in 2.2 Dimethoxypropane, then desiccated to critical point and finally coated with gold. Results: The anthers are dithecal and supported by a long filament made up of an epidermal stratum, parenchymal tissue, and a vascular bundle. The dehiscence occurs longitudinally through the stomium. The anther wall is made up of a monostratified epidermal layer, followed by a layer of endothecial cells with lignified fibrillar thickenings, cellular remnants of tapetum and abundant orbicules can be seen covering the cavity of the microsporangia. The epidermal and parenchymal tissues of the anthers are abundant in polyphenols. Orbicules are generally spherical, psilated, and these exhibit the same staining and fluorescence reactions as exine from pollen grains. The pollen grains are monades, isopolar, small (16-19 µm) with circular amb, spheroidal, tricolpate with medium or short colpi (5-10 µm) with sculptured membrane, semitectate, reticulated, heterobrochate, sculptured or non- sculptured walls, with microgranules of different size or scabrate. The statistical analyzes showed that there are significant differences in the size of the pollen grains (P ˂ 0.05). It is observed that the smallest pollen grains are those of the TCS 19 genotype (16.890 µm) and are different from the other genotypes, and among these there are no significant differences. Only two genotypes (SCC 19 and SCA 6) showed pollenkit and only one has perforated walls (SCA 6). Conclusions: The structure and micromorphology of the anthers of T. cacao are similar to those described for other Malvaceae. Likewise, the pollen grains showed variations in size, ornamentation of the sporoderm and the lumen of the reticulum and the presence of pollenkitt. However, no relationship was observed between the micromorphological characters analyzed in the pollen grains and the pollen compatibility models reported for these genotypes.